原位雜交實(shí)驗(yàn)郵寄樣本的注意事項(xiàng)
原位雜交已成為當(dāng)今細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)研究的重要手段。
信帆生物，可進(jìn)行mRNA, lncRNA, circRNA, micRNA等各類RNA分子和DNA的原位雜交檢測(cè)。
可接收石蠟切片、冰凍切片、細(xì)胞爬片等實(shí)驗(yàn)樣本，可以做DAB，NBT，熒光單標(biāo)，雙標(biāo)，三標(biāo)等不同顯色系統(tǒng)的檢測(cè)。
原位雜交實(shí)驗(yàn)的送樣要求
1、切片前處理要求
新鮮組織干冰運(yùn)輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內(nèi)投入原位雜交固定液內(nèi)固定，4℃低溫保存運(yùn)輸，切勿冷凍結(jié)冰；盡快包埋切片后進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，固定時(shí)間過長(zhǎng)影響核酸檢出率；
2、冰凍切片
冰凍切片-20℃運(yùn)輸；
3、石蠟切片
石蠟切片常溫運(yùn)輸；
4、 細(xì)胞爬片
細(xì)胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運(yùn)輸。
石蠟切片 熒光原位雜交 實(shí)驗(yàn)流程
下面以石蠟切片熒光原位雜交為例來具體介紹一下原位雜交的實(shí)驗(yàn)流程(具體實(shí)驗(yàn)參數(shù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化)。
1
石蠟切片脫蠟至水
依次將切片放入環(huán)保型脫蠟透明液Ⅰ(貨號(hào)G1128，15 min)-環(huán)保型脫蠟透明液Ⅱ(貨號(hào)G1128，15 min)-無水乙醇Ⅰ(5 min)-無水乙醇Ⅱ(5 min)-85%酒精(5 min)-75%酒精(5 min)-無酶水(貨號(hào)：G4700)。
2
修復(fù)
組織切片浸沒于1×修復(fù)液(貨號(hào)：G1202)中，加熱修復(fù)(如用微波爐加熱，可中火7分鐘，停火7分鐘，中低火6分鐘)。
3
消化
組化筆(貨號(hào)：G6100)畫圈，將蛋白酶K(貨號(hào)G1234)稀釋至20μg/mL滴加到組織上，再放入恒溫箱40℃消化20-30min，接著用無核酸酶PBS緩沖液(貨號(hào)：G4202)洗3次，每次5min(最優(yōu)消化條件需根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，以獲得最佳實(shí)驗(yàn)效果)。
4
預(yù)雜交
輕輕甩干切片，滴加40℃預(yù)熱的雜交液覆蓋組織，放入恒溫箱40℃孵育30 min。
5
雜交1
倒掉雜交液，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物1雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃孵育3h。(注意防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同靶標(biāo)的探針混合物1進(jìn)行雜交。賽維爾生物提供探針合成服務(wù))
6
雜交后洗滌
倒掉雜交液，將切片依次用40℃預(yù)熱的2× SSC、1× SSC、0.5× SSC、0.1× SSC(20×SSC緩沖液，貨號(hào)：G3015，用無核酸酶水稀釋)各漂洗5 min(如非特異性雜交體較多，可以在此步增加洗滌時(shí)間、次數(shù)及調(diào)整雜交液中甲酰胺濃度)。
7
雜交2
輕輕甩干切片，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的探針混合物2雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min(此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同靶標(biāo)的探針混合物2進(jìn)行雜交)。
8
雜交后洗滌
同第6步
9
信號(hào)雜交
輕輕甩干切片，滴加60 μL 40℃預(yù)熱的信號(hào)探針雜交液，水平置于濕盒再放入恒溫箱40℃雜交45 min(此過程中可在濕盒底部加入50ml 2× SSC，防止干片。做多標(biāo)時(shí)可同時(shí)添加不同信號(hào)探針進(jìn)行雜交)。
10
雜交后洗滌
同第6步
根據(jù)不同的信號(hào)探針，選用不同的顯色系統(tǒng)，本次是熒光探針，所以進(jìn)行DAPI染色：
11
DAPI染核
切片用無核酸酶的PBS緩沖液(貨號(hào)：G4202)潤(rùn)洗，切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染色試劑(貨號(hào)：G1012)，避光室溫孵育8 min。
12
封片
切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑(貨號(hào)：G1401)封片。
13
圖像采集分析
最后進(jìn)行鏡檢拍照，或熒光共聚焦拍照(可選)，或切片掃描(可選)。
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